12、番外·我们的未来 ...
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1．基因组的特点
特征原组真组病组
核酸DNA和RNADNA和RNADNA和RNA
基因组较小较大基因较少，不同病毒
大小基因数目较少基因数目较多基因组大小和数目差别大
结构基因
特征多顺反子mRNA
无内含子
编码序列不重叠断裂基因有内含子
单顺反子，重复序列
非编码区》编码区5’端有帽子结构
3’端有poly（A）尾
两端具有粘性末端
重叠基因，分段基因
其他特征环状双链DNA
仅一个DNA复制起点
只是一类核结构
其操纵子结构线状双链DNA
二倍体双链DNA分子两端具有
正向重复序列和反向重复序列
质粒的定义染色体以外，能独立复制并稳定遗传的闭合换装DNA分子
质粒的生物学特征
1，所有的质粒都是环状超螺旋DNA分子，质粒较小，比较稳定。在实际操作中不易受物理因素的损伤
2，质粒的可复制性 3，质粒的不可相容性，同一类群的不同质粒通常不能在同一菌株内稳定共存
4，质粒的可扩增性 5，质粒的可转移性 6，质粒的选择标记性
开放的阅读框架（ORF）由始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子组成的核苷酸序列被称为ORF
重叠基因许多病毒基因组的一段DNA序列有两个或两个以上的ORF，可以编码两种甚至三种以上的多肽链称为重叠基因。
断裂基因真核细胞内的结构基因并非完全由编码序列组成，而是在编码序列中插入了非编码序列。这类基因被称为断裂基因。
正链病毒病毒基因组序列与mRNA相同，可直接作蛋白质合成的模板，称为正链RNA病毒。
基因定义 DNA携带的遗传信息通过转录传递给RNA，mRNA通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程。
基因的表达和调控发生水平转录水平翻译水平翻译后水平
转录水平的调控元件启动子增强子沉默子终止子
翻译水平的调控元件 SD序列
操纵子由一组功能相关的结构基因，连同上游调控序列共同构成的一个转录单位
乳糖操纵子结构组成由调节序列和结构基因两部分组成，调控序列包括启动子、较远端的调节基因、操纵基因。
乳糖操纵子负调控模式 1，乳糖缺乏时，抑制物基因与操纵基因相互作用，阻止RNAP启动酶基因转录；2，乳糖浓度增高而葡萄糖浓度降低时，异半乳糖与Lac阻遏因子结合并诱导该因子变构，促使阻遏因子与操纵基因解离，加速其结构基因转录
乳糖操纵子正调控模式葡萄糖量降低时，菌体内CAMP含量增加，形成CAMP-CAP复合物，该复合物与其特异位点CAP结合，可促进转录。
核酸的分离纯化原则 保持核酸一级结构的完整性，尽量保持核酸的纯度。
核酸的分离纯化技术路线核酸的释放，核酸的分离与纯化，核酸的浓缩沉淀洗涤
核酸分离纯化中EDTA、SDS、酚/□□/异戊醇、70%乙醇作用
EDTA：三价金属离子螯合剂，可以螯合激活DNA酸所需的Mg2+、Ca2+等，从而抑制DNA酸活性，降低细胞膜稳定性SDS：阴离子去垢剂。降解细胞膜及乳化脂质蛋白质酚/□□/异戊醇：一种强蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酸活性。70%乙醇：洗涤可去盐
提取的核酸的浓度可用什么方法鉴定紫外分光光度法
0D260=1时，相当于DNA、RNA、寡核酸分别多少浓度
双链DNA含量=50mg/ml
单链DNA或RNA含量=40μg/ml
单链寡核苷酸含量=33μg/ml
提取的核酸纯度可用什么方法鉴定纯DNA的A260/A280=1.8，高质量RNA的A260/A280=2.0 紫外分光光度法
当提取的DNA有降解时在电泳图谱上有何表现电泳图谱呈拖尾状
当提取的RNA有降解时在电泳图谱上有何表现 28s或22s，RNA的荧光强度低于18s或16sRNA的两倍
当提取的RNA版友DNA污染时在图谱上有何表现点样孔附近有着色带
分离纯化的DNA和RNA如何保存 DNA：PH=8.0的TE缓冲液中RNA：0.3mol/L的NaAc溶液中,-20℃
什么是重组DNA技术不同来源地DNA分子通过磷酸二酯键而链接成新的DNA分子
限制酶概念是DNA重组技术的基本工具，识别回文结构和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶
回文结构、粘性末端、感受态、转化概念回文结构：双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列粘性末端：限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链产生的末端感受态：细胞膜结构改变，通透性增加并具有摄取外源DNA能力的状态转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入受体细胞的过程
DNA连接酶：催化双链中相互邻近的5’磷酸末端和3’-OH末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中的切口或将两个DNA分子连接起来
碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团，减少自连
TagDNA聚合酶：形成DNA新链，形成3’-5’磷酸二酯键
T4核苷酸激酶：5’端羟基磷酸化，标记探针5’端
载体概念携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具
按照功能分类载体克隆载体、表达载体、穿梭载体
按照来源分，那些物质可作载体质粒载体、噬菌体载体、真核病毒载体
作为载体的条件自主复制、具备筛选标记、多克隆位点、拷贝数高、具有较高遗传稳定性、分子量小易于转化
重组DNA技术线路目的基因获取，载体的选择，目的基因与载体连接或重组DNA，重组DNA导入受体细胞，重组体筛选
根据载体上的遗传标记来筛选阳性重组子有哪些方法抗生素抗性、蓝白斑筛选、酶基因标记
根据阳性重组子的特征来筛选阳性重组子的方法电泳（根据分子量大小）、western blatt免疫印迹技术、酶切鉴定、PCR筛选、序列测定
蓝白斑筛选原理质粒载体含有lacZ’标记基因，柏含大肠埃希菌β-半乳糖苷酶基因的调控序列和该酶N端的由146个氨基酸组成的α-肽的编码序列，无酶的活性；宿主细胞的染色体DNA含有β-半乳糖苷酶，将无色的所用底物水解为蓝色产物，即所得的α-互补作用面形成蓝色菌落，当外源性基因插入lacZ’基因的多克隆位点，无α互补能力，带重组质粒的细菌形成白色菌落。
PCR原理依赖DNA变性与复性的原理。在DNTP特性引物、模板DNA的作用下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应过程，有变性、退活、延伸3个过程循环进行。
PCR反应体系模板、一对引物、DNA聚合酶、PCR缓冲液（Mg2+）、DNTP
PCR产物可用什么方法检测琼脂糖凝胶电泳鉴定、测序（测定核苷酸序列）
PCR特点特异性强、灵敏度高、简便快捷
巢式PCR概念：有两对引物对应的序列在模板外侧，称外引物；另一对引物互补序列在统一模板的外引物内侧，称内引物。即引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列。经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA序列检出。
逆转录PCR：是一种检验RNA方法，其原理是先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。
锚定PCR：首先分离总RNA或mRNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA。通过DNA末端转移酶在CDNA的3’端加上poly（A）尾，与此poly（A）尾对应的锚定引物为poly（dc）。为保证扩增特异性，poly（dc）应在带上限制性酶序列或其他序列信息。
荧光PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号检测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对未知模板核酸进行定量分析。
循环阈值（ct）：在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
探针概念：核酸探针是指能与待测的靶核酸序列特异互补杂交的已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且通常带有某种适当的标记以便检测。
核酸分子杂交技术概念：用标记的已知DNA或RNA片段来检测样品中未知核酸序列，再经显影或显色的方法将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。
探针的标记方法：1，化学法：光敏生物素标记核酸探针，酶标记核酸探针
2，酶促法：缺口平移法，随机引物法，DNA探针的末端标记，聚合酶链反应标记DNA探针，RNA探针的标记，寡核苷酸链标记
杂交结果的检测方法：根据探针标记方法检测；非放射性探针用显色
Western-blot：是一种通过标记的抗体检测经SDS-PAGE分离的特定蛋白质的技术
原位杂交：是在保持细胞形态的条件下检测细胞内DNA或RNA的定位。
常用的测序方法：1，双脱氧链终止法 2，化学测序法
Sanger双脱氧链终止法测序原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立4种相互独立的反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸作为链延伸终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶部到顶部按5’-3’方向读出新和成链序列，由此推知待测模板链的序列。
生物芯片技术：生物芯片类型：1，微阵列芯片：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片；2，微流体芯片：毛细管电泳芯片，PCR反应芯片，介电电泳芯片
基因芯片概念：将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称基因芯片。
作者有话说
第12章 番外·我们的未来
